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Todas las suscripciones de pago incluyen actualizaciones de software para la duración del período de suscripción, soporte técnico, y el acceso a la documentación oficial en línea. Orden JyMOL Online Desde el Libro 1: Hawai es palmeras, arena y agua azul negro y mdash; pero para policía Lei Texeira, allí y rsquo; s un lado oscuro en el paraíso. Lei ha superado un pasado lleno de cicatrices para hacer una vida para sí misma como un policía en el pueblo soñoliento gran isla de Hilo. En un recorrido de rutina se encuentra con dos adolescentes y mdash asesinados, uno de los cuales ella y rsquo; d recientemente reventado. Con sus ecos de su propio pasado, la niña asesinada y rsquo; s dura vida y la muerte trágica afectar profundamente Lei. Ella se obsesiona y mdash; incluso cuando el asesino se señala a la intensidad de Lei, alimentándose de sus vulnerabilidades y jugando con ella sanity. Despite su obsesión con el caso y el miedo de que ella está siendo acosada, Lei encuentra a sí misma cayendo en el amor por primera vez. humeantes volcanes, playas de arena negra y bosques de helechos envueltos son el telón de fondo para la búsqueda de respuestas para Lei & mdash; y el acosador está más cerca de lo que puede imaginar, como hilos del pasado enredo en su futuro. Lei está decidido a encontrar al asesino y mdash; pero sabe dónde encontrarla primero. misterio del crimen de ritmo rápido con un toque de romance, los lectores llaman las orquídeas de sangre "no-putdownable!" "A veces en la novela negra que tropezar a través de un personaje que vive en el más allá del final del libro, en virtud de su complejidad psicológica, y la riqueza con la que el autor los ha dibujado. Will Graham, Jack Reacher, Alex Cruz, y ahora tienen un digno . contraparte femenina en Lei Teixeira orquídeas de sangre es una rareza entre las novelas de debut, en el que se satisface en cada nivel un nuevo y poderoso talento está en la escena, de todo corazón recomendado. "-. dibujó Cruz, ex policía y autor de Bitemarks Los libros de esta serie (12 libros) Ocultar ya libros en su biblioteca (0) 30/09/16 Louisville consigue buenas noticias en el esfuerzo para revitalizar el barrio Russell Louisville es un paso más para la recepción de fondos necesarios para la revitalización del barrio Russell, que incluiría la demolición y sustitución del 760-unidad de desarrollo de vivienda Beecher terraza. 28/09/16 Disminución de la refinanciación de la hipoteca más baja empuja aplicaciones prestatarios de hipotecas claramente se están acostumbrando a las tasas de interés históricamente bajos de las. Una caída en los precios de la semana pasada no hizo nada para refinanciamientos de jugo, que suelen ser muy sensibles a las tasas. 26/09/16 La desaparición misteriosa de la repetición compradores de vivienda Mucha tinta se ha derramado sobre los males de los compradores de vivienda por primera vez, pero ¿qué pasa con los compradores de vivienda de repetición? 22/09/16 Por qué la vivienda no se preocupa por la Fed De NT-proBNP: una nueva herramienta de cribado diagnóstico para diferenciar entre pacientes con función sistólica normal, y ventricular izquierda reducida Objetivo: Evaluar si las mediciones de N-terminal pro-péptido natriurético cerebral (NT-proBNP) se pueden utilizar para diferenciar a los pacientes con normal y reducción de la fracción de eyección ventricular izquierda (FEVI) en un grupo consecutivo no seleccionada de pacientes hospitalizados. : Hospital General de la ciudad, Copenhague, Dinamarca. Pacientes y diseño: Durante un período de 10 meses 2230 admisiones en un hospital general de la ciudad (80% de los pacientes destinatarios) tenían una evaluación ecocardiográfica de la función ventricular izquierda, una evaluación clínica completa, y análisis de sangre de péptido natriurético N-terminal pro-brain (NT-proBNP) dentro de las 24 horas de ingreso. Las exclusiones se debieron a la falta de consentimiento informado o no obtención de las evaluaciones requeridas antes de la muerte o el alta hospitalaria. La ecocardiografía no fue satisfactoria en 37 pacientes, por lo que el número final estudiada era de 2193. RESULTADOS: Un elevado de NT-proBNP (> / = 357 pmol / l) identificado pacientes con una FEVI del 40% fue de más de 97%. Esta probabilidad disminuyó rápidamente a 70% como el medido NT-proBNP aumentó a 150% del valor predicho. CONCLUSIONES: Una sola medición de NT-proBNP en el momento del ingreso en el hospital proporciona información importante acerca de la FEVI en pacientes no seleccionados. Bay M, et al. Corazón Feb 2003; 89 (2): 150-4 catecolaminas plasmáticas y proBNP N-terminal en pacientes con infarto agudo de miocardio sometidos a angioplastia primaria Relación de la función ventricular izquierda y el resultado clínico ANTECEDENTES: Ni los perfiles ni valor pronóstico de los marcadores neurohormonales se han evaluado de forma prospectiva en pacientes con infarto agudo de miocardio (IAM) tratados con angioplastia primaria. MÉTODOS Y RESULTADOS: En 118 pacientes consecutivos con IAM sometidos a reperfusión exitosa (TIMI 2 y 3) con angioplastia primaria, las concentraciones plasmáticas de norepinefrina, epinefrina y proBNP N-terminal (NT-proBNP) se midieron antes, 60 min y 10 días después de la angioplastia . las concentraciones de catecolaminas (media +/- SEM) se elevó a un máximo en la primera hora después de la angioplastia (norepinefrina: 602 +/- 44ng / L, epinefrina: 213 +/- 24ng / L) y volvieron a la normalidad en el día 10. Por el contrario, NT - proBNP niveles mantienen un aumento adicional de 799 +/- 44 pmol/L al inicio a 924 +/- 54 pmol/L en el día 10. una concentración de NT-proBNP por encima de la mediana a los 60 min post-angioplastia predice eventos cardiacos adversos mayores (n = 27) durante el 18-36 meses de seguimiento con una odds ratio de 5,9 (1,7-20,3) y fue superior a las catecolaminas, la fracción de eyección del ventrículo izquierdo y de otros marcadores de riesgo postinfarto establecidos. Conclusiones: En una cohorte de bajo riesgo de los pacientes con IAM sometidos a terapia de reperfusión exitosa, las concentraciones en plasma de NT-proBNP son elevados durante al menos diez días. El valor pronóstico de plasma principios de NT-proBNP se debe evaluar exhaustivamente en relación con su capacidad para facilitar la estratificación del riesgo de los pacientes con infarto. Hartmann F, et al. Z Kardiol 2003 Ene; 92 (1): 73-81 Prueba de sangre predice la supervivencia del paciente del corazón Un análisis de sangre de acción rápida y de bajo costo podría ayudar a determinar quien se enfrentará el mayor riesgo de complicaciones a largo plazo después de un ataque al corazón o dolor en el pecho. La nueva investigación demuestra la prueba son un mejor indicador de riesgo de un paciente de la muerte después de tales problemas cardiacos importantes que otros métodos disponibles en la actualidad. Cuando el corazón se sobrecarga, que segrega una hormona llamada péptido natriurético tipo B (BNP), que actúa como un diurético natural para ayudar a la función de retorno del corazón a la normalidad. En los últimos años, la detección de los niveles de BNP se ha convertido en una forma común para el personal de la sala de emergencia para diagnosticar insuficiencia cardíaca rápida y comenzar el tratamiento más rápido. Pero ahora los investigadores dicen que el análisis de los niveles de un fragmento de esta hormona conocida como el fragmento N-terminal (N-BNP) pueden predecir con mayor precisión los riesgos a largo plazo en pacientes con ataque al corazón o dolor en el pecho (angina de pecho) que mirando BNP solo. Ellos encontraron que los pacientes con los niveles más altos de N-BNP tenían el doble de riesgo de morir que aquellos con los niveles más bajos. Su estudio aparece en la edición de hoy el acceso rápido de Circulación: Revista de la Asociación Americana del Corazón. investigador del estudio, Kenneth Caidahl, MD, PhD, profesor de fisiología clínica del Hospital Universitario de Sahlgrenska en Goteborg, Suecia y sus colegas midieron los niveles de N-BNP en 609 pacientes con ataque al corazón o dolor en el pecho (también conocido como síndrome coronario agudo o SCA) que eran admitido en el hospital entre 1995 y 2000. Después de un promedio de alrededor de cuatro años de seguimiento, encontraron que los niveles de N-BNP fueron significativamente inferiores en los supervivientes que los que habían muerto durante el estudio. Y el riesgo asociado con altos niveles de N-BNP siguió siendo significativa incluso después de ajustar por la edad del paciente o antecedentes de insuficiencia cardíaca. Los investigadores dicen que los resultados son especialmente significativos porque este marcador también predijo el riesgo de muerte incluso entre pacientes sin otros signos medibles de daño al corazón. En un editorial que acompaña al estudio, James A. de Lemos, MD, de la Universidad de Texas Southwestern Medical Dallas y David A, Morrow, MD, MPH, del Hospital Brigham y de Mujeres de Boston, dicen que los resultados muchas preguntas importantes sobre el uso de BNP como un indicador de riesgo cardíaco. Ellos escriben que "la magnitud de la relación riesgo asociado con BNP parece ser mayor que la asociada con marcadores más disponibles en la actualidad. Claramente, BNP nos está diciendo algo que no hemos hecho anteriormente sabemos acerca de los factores asociados con el riesgo en pacientes con SCA." Jennifer Warner. WebMD Medical News. (11 de noviembre 2002) N-terminal pro-B-péptido natriurético tipo y la mortalidad a largo plazo en los síndromes coronarios agudos. Antecedentes:-péptido natriurético tipo B (BNP) es un predictor de pronóstico a corto y medio plazo en todo el espectro de los síndromes coronarios agudos (SCA). El fragmento N-terminal de la prohormona BNP, N-BNP, puede ser un marcador pronóstico aún más fuerte. Se evaluó la relación entre los niveles plasmáticos subagudo N-BNP y largo plazo, todas las causas de mortalidad en una cohorte grande, contemporánea de los pacientes con SCA. Métodos y Resultados: Las muestras de sangre para la determinación de N-BNP se obtuvieron en la fase subaguda en 204 pacientes con elevación del ST infarto de miocardio (IM): 220 con la no elevación del segmento ST infarto de miocardio y angina inestable con 185 en la fase subaguda. Después de una mediana de seguimiento de 51 meses, 86 pacientes (14%) habían muerto. los niveles de N-BNP promedio fueron significativamente inferiores en los supervivientes a largo plazo que en los pacientes que mueren (442 frente a 1306 pmol / L; P la medición de noche rápido del péptido natriurético cerebral en pacientes con insuficiencia cardíaca crónica ANTECEDENTES: Cerebro niveles de péptido natriurético (BNP) se han utilizado para evaluar el estado clínico y predecir el pronóstico de los pacientes con insuficiencia cardíaca crónica (ICC). Sin embargo, los niveles de BNP sólo pueden medirse en laboratorios especializados que ha hecho difícil su uso en la práctica clínica diaria. Se comparó un nuevo ensayo de BNP, rápida, con una medición de BNP convencional y se evaluó la aplicabilidad a la práctica actual, comparándola con parámetros clínicos estándar. Métodos: Los niveles de BNP se determinaron en 78 pacientes con ICC estable y 20 controles. La severidad de la ICC se evaluó mediante la determinación de la clase funcional de la New York Heart Association (NYHA), fracción de eyección ventricular izquierda (FEVI) y el consumo de oxígeno pico (pico de VO (2)), y estos parámetros se compararon con los niveles de BNP. RESULTADOS: En general, la evaluación rápida de BNP fue altamente correlacionado con el ensayo BNP convencional (r = 0.95, P 200 pmol / l), sin embargo, la correlación fue menos precisa, y tienden a sobreestimar. Los niveles de BNP también estrechamente correlacionados tanto con la clase NYHA, FEVI y el pico de VO (2) (todos p Medición comparativa de la N-terminal pro-péptido natriurético cerebral y péptido natriurético cerebral en pacientes ambulatorios con insuficiencia cardiaca No está claro si el péptido natriurético cerebral (BNP) o proBNP N-terminal (NT-proBNP) es superior como indicador de diagnóstico y pronóstico en enfermedades cardíacas. Aquí, comparamos las correlaciones clínicas de ambos péptidos en una población de 92 pacientes ambulatorios con insuficiencia cardíaca, utilizando un ensayo bien establecido inmunorradiométrico (IRMA) para BNP y un inmunoensayo de electroquimioluminiscencia automatizado para NT-proBNP. La correlación analítica entre los dos péptidos fue satisfactoria en un amplio intervalo de concentraciones (1-686 pM para BNP) con la ecuación: NT-proBNP = 3,48 x BNP -19 y un coeficiente de correlación r2 = 0.94. Además, la concentración de ambos péptidos aumentó de una manera similar de acuerdo con la gravedad de la enfermedad New York Heart Association (NYHA) clase funcional, fracción de eyección ventricular izquierda, etiología) y la edad; por ejemplo, las proporciones entre los niveles medios medidos en NYHA clase III vs. clase II, los pacientes fueron comparables para BNP (383 vs. 16 pM, la relación de 24) y NT-proBNP (1306 vs. 57 pM, la relación de 23). Se concluye que la N-terminal proBNP, como se ensayó en el presente estudio, se correlaciona igualmente a BNP con variables clínicas en pacientes con insuficiencia cardíaca. Masson S, et al. Clin Chem Lab Med 2002 Aug; 40 (8): 761-3 Un ensayo de péptido natriurético de tipo B rápida diagnostica con precisión la disfunción ventricular izquierda e insuficiencia cardíaca: una evaluación multicéntrico ANTECEDENTES: B-péptido natriurético tipo (BNP), una proteína liberada desde el ventrículo izquierdo en respuesta a la expansión del volumen y la sobrecarga de presión, se ha convertido en el primer marcador de sangre completa para la identificación de las personas con insuficiencia cardíaca congestiva (ICC). OBJETIVO: El propósito de este estudio fue evaluar el rendimiento de un ensayo de punto de atención para diagnosticar y evaluar la gravedad de CHF sobre la base del sistema de clasificación de la New York Heart Association (NYHA). MÉTODOS: A través de un estudio prospectivo, multicéntrico, muestras de sangre total se obtuvieron de un total de 1050 pacientes hospitalizados, pacientes ambulatorios y pacientes control sanos. Los participantes se dividieron en subgrupos para el análisis de BNP: pacientes sin CHF cardiovasculares (n = 473), los pacientes con hipertensión y sin enfermedad cardiovascular (n = 168), clase I de la NYHA CHF (n = 73), clase II CHF (n = 135) , clase III CHF (n = 141), y la clase IV CHF (n = 60). Resultados: las concentraciones circulantes de BNP determinados a partir del ensayo de cabecera aumentaron con la gravedad de CHF, según lo determinado por el sistema de clasificación NYHA, pero sólo fueron estadísticamente significativas (P 1300 pg / ml), respectivamente. Con el uso de un umbral de decisión de 100 pg / ml, el ensayo demostró una sensibilidad de 82% y 99% de especificidad para distinguir los pacientes de control y los pacientes con ICC. Conclusiones: Las concentraciones de BNP obtenidos a partir de muestras de sangre entera son útiles en el diagnóstico de la CHF y la estadificación de la gravedad de la enfermedad. SJ Wieczorek. et al. Am Heart J 2002 Nov; 144 (5): 834-9 Las concentraciones plasmáticas perioperatorias del péptido natriurético auricular y del cerebro en pacientes sometidos a artroplastia de cadera hipotensión aguda, hipoxemia transitoria y la elevación de la presión arterial pulmonar son bien conocidos por ocurrir durante la artroplastia cementada. El objetivo de este estudio clínico prospectivo fue caracterizar la relación entre las concentraciones plasmáticas de la aurícula y los péptidos natriuréticos cerebrales (ANP, BNP), y los cambios en la presión arterial en pacientes sometidos a artroplastia de cadera. Los niveles elevados de ANP y BNP pueden ser marcadores de reserva de miocardio insuficiente. Medimos ANP plasma y los niveles de BNP antes de la operación y 20 minutos después de la cementación en 18 pacientes (54-90 año). Se definió una respuesta hipotensora después de la cementación como una disminución en la presión arterial sistólica de más de 15 mm Hg por debajo del valor previo a la cementación. En el grupo hipotensor, los valores preoperatorios de ANP fueron 123 +/- 48,5 pg / ml y BNP, 138 +/- 71,7 pg / ml. Estos valores son significativamente mayores que los del grupo de normotensos (ANP 35,9 +/- 7,7, y BNP 17,2 +/- 3,2 pg / ml). Los altos valores preoperatorios de ANP y BNP se asocian con más hipotensión durante la artroplastia cementada y podrían proporcionar una indicación de qué pacientes están en riesgo de esta complicación. Terasako K. Anaesth Cuidados Intensivos 2002 Oct; 30 (5): 588-90 Natriuréticos de tipo B: niveles de péptido potencial diagnóstico y terapéutico Un análisis de sangre que ayuda en el diagnóstico y tratamiento de pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva tendría un impacto favorable en los enormes costos de la enfermedad. De tipo B péptido natriurético (BNP) se sintetiza en los ventrículos cardíacos y su liberación es directamente proporcional a la expansión del volumen ventricular y sobrecarga de presión. Los niveles de BNP se correlacionan con la presión ventricular izquierda, la cantidad de la disnea, y el estado de modulación neurohumoral. BNP también se correlaciona estrechamente con la clasificación de la New York Heart Association. Un punto de 100 pg / ml corte parece discriminar a los pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva de los que no tienen insuficiencia cardíaca congestiva. La medición de BNP también puede ser una excelente herramienta de detección para la disfunción LV. Maisel A. Cardiovascular Toxicology 2001; 1 (2): 159-64 Mapeo de cáncer de riñón humano y tejido renal (H-011-23) Concéntrese muestra de plasma en 1.5x, 2.0xy 2.5x: 150ul liofilizado, 200 ul y 250ul plasma y rehidratar en tampón RIA 100 ul. (Cat. Nº 011-42-RK) Los resultados preliminares de nuestro laboratorio mostraron niveles de plasma fresco N-BNP en sujetos sanos = 714 y plusmn; 19,9 pg / ml (media y plusmn; SD, n = 16). Este nivel puede variar de laboratorios. Este kit está destinado para uso exclusivo en investigación. Ver otros niveles de péptidos en el plasma humano normal: los niveles normales de plasma Péptidos BNP (1-76), N-terminal, Pro (NT-pro-BNP) (Humano) - Kit RIA (RK-011-42) Protocolos: Reacción en Cadena de la Polimerasa Protocolos: extracción de ADN | Reacción en cadena de la polimerasa Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) En pocas palabras, la PCR es como fotocopias regiones de ADN. Brevemente, los cebadores (secuencias cortas de ADN) que coinciden con el comienzo y el final de un gen particular de interés (o parte de uno) se mezclan con el DNA de salmón extraído, junto con una enzima de ADN polimerasa y unos pocos productos químicos (incluyendo MgCl 2 y un tampón salino) que ayudan a la labor de reacción adecuadamente. Los cebadores se diseñaron de modo que hay un cebador directo que coincide con el extremo 5 'de una de las cadenas complementarias del ADN de salmón, y un cebador inverso que coincide con el extremo 5' de la hebra de ADN opuesta. Todo lo que hace el termociclador es el cambio de temperatura para ciertos períodos de tiempo, lo que permite que diferentes partes de la reacción de PCR que se produzca. En primer lugar se eleva la temperatura a 94 ° C (casi hirviendo!) Y las cadenas de ADN de doble hélice del salmón resquebrajarse (recordemos que sólo están unidas por puentes de hidrógeno relativamente débiles). Este paso se llama la etapa de desnaturalización, (eso es lo que se llama cuando las cadenas de ADN están obligados a separarse). A continuación, la temperatura se enfría a algún lugar entre 50 O y 60 ° C (dependiendo de la secuencia del cebador), que permite que los cebadores se unen a sus secuencias complementarias en cada cadena de ADN (llamado la etapa de recocido). A continuación, la temperatura se eleva a 72 o. la temperatura a la que la enzima ADN polimerasa que funciona mejor. Esta polimerasa de ADN se obtiene a partir de bacterias que viven en aguas termales, por lo tanto la alta temperatura a la que funciona. El nombre de la bacteria Thermus aquaticus es la ADN polimerasa y deriva su nombre del nombre de la polimerasa Taq científica. La ADN polimerasa comienza en los cebadores y & quot; dice & quot; el resto de la cadena, llenando en todos los nucleótidos coinciden correctos. En un minuto más o menos, la enzima se ha completado la hebra complementaria utilizando la hebra de la inicial como plantilla (llamado el paso de extensión). Este ciclo se repite de 30 a 40 veces, con cada ciclo de producción de una duplicación de la región de ADN entre los dos cebadores. Teóricamente este proceso produciría 2 40 copias de la región. Por supuesto, la reacción no llega a este límite teórico, pero el resultado final será con cientos de millones de copias, que aparecen como una banda brillante en un gel (con suerte!), Y es lo suficientemente para picar más tarde con una enzima de restricción (al lado sección). Si una banda brillante no se muestra, a continuación, una segunda ronda de PCR se puede realizar utilizando una pequeña cantidad de la primera ronda de reacción para generar un mayor número de copias. Lo siguiente está escrito utilizando el locus de gonadotropina como un ejemplo. Las condiciones varían ligeramente de otros loci. Haga clic aquí para obtener más información acerca de gonadotropina locus. Protocolo para el uso de Taq polimerasa líquido: (Los maestros pueden solicitar de Qiagen Corp. un kit de extracción de ADN (suficiente para 50 muestras) y el kit de polimerasa Taq. Llame a Sonia Dobias al 1-800-426-8157 Ext. 23544) Las secuencias de los cebadores de gonadotropina son: (5 'a 3') 1ª ronda secuencias de cebadores (F1 / R1): 2ª ronda secuencias de cebadores (F1a / R1a): F1. 5'-GGA gato tgt cta cac tca c-3 'F1a. 5'-GTC acto ctc ctc ttc acc g R1. 5'-tac etiqueta TCT TTG GGT AAT GC-3 'R1a. 5'-GGC TGC agg CTC TCG ATG g Los cebadores son relativamente baratos. Para obtener información sobre pedidos, véase la sección Fuentes. Nota: Los cebadores llegarán seco en tubos eppendorf similar. Usted tendrá que añadir agua destilada para volver a disolver ellos. La cantidad de imprimación presente en el tubo será impreso en la etiqueta del tubo. La cantidad será normalmente alrededor de 50 nmol. Será necesario que las existencias de 0,25 pmol / ul para su uso en la PCR. (Tenga en cuenta que este es un primer concentración mucho más baja que la utilizada para el proyecto de mejillón). Comience por hacer una 100 pmol / ul de stock de la disolución de imprimación en 10 veces la cantidad de agua (en ul) y cuando tenga nmol. Por lo tanto, si usted tiene 50 nmol, se disuelven en 500 l de agua y tendrá 100 pmol / ul. (Recuerde, 50 nmol = 50.000 pmol. Así, 50.000 horas / 500 ul = 100 pm / ul, ¿verdad?). A continuación, puede diluir 1: 400 para obtener su 0,25 pmol de stock / ul de trabajo. 1) Número de paredes finas de 0,2 ml tubos de PCR en la parte superior y lateral con marcador permanente fino. 2) Hacer un & quot; cóctel & quot; que incluye tampón 10X PCR, nucleótidos, choloride magnesio, cebadores, polimerasa Taq, y agua (pero no el ADN). Calcule lo que se necesita añadir al cóctel utilizando la siguiente receta. Digamos que usted está haciendo lo suficiente cóctel para la clase, lo que está haciendo 18 muestras (sólo para hacer los cálculos fácil). Usted va a querer lo suficiente cóctel para estas 18 muestras más 1 control negativo (para la clase). Para asegurarse de que tiene suficiente cóctel, calcular suficiente por un tubo extra: Por tubo x 20 (18 muestras, más 1 control negativo, 1 adicional) tampón 10X PCR de 2,5 ml ul 50 mM dNTPs 5 1 ml 20 ml 25 mM de MgCl 2 1 ml 20 ml 5 Primer (F1) (0,25 pmol / ml) 1 ml 20 ml 3 Primer (R1) (0,25 pmol / ml) 1 ml 20 ml de Taq polimerasa 0,15 ml 3 ml ddH2O 16.35 ml 327 ml totales de cóctel: 460 ml (Nota: Si cada grupo de laboratorio está haciendo su propio cóctel, simplemente multiplica el & quot; por tubo & quot; cantidades por uno más que el número de muestras que su grupo está haciendo; por ejemplo, si su grupo está haciendo 4 muestras, producen suficiente cóctel para 5 muestras , por lo que tiene un poco de sobrepeso). DNA. 2 m l (no en cóctel!) 3) Añadir 23 m l del cóctel para cada tubo de PCR pequeña. 4) Añadir 2 m l de su ADN en el tubo de PCR, por lo que el volumen final es de 25 ul. 5) Mezclar el contenido del tubo con la pipeta suavemente dentro y fuera. (Si está seguro de que su pipetearon 2 m l de ADN directamente en el resto de la mezcla, es necesaria ninguna mezcla). 6) Colocar las muestras en el termociclador e iniciar los ciclos de las instrucciones de su maestro. El termociclador se programó con el siguiente perfil general (el perfil de ciclos óptimo para un termociclador dado variará y debe ser determinada empíricamente): Primera ronda: 1 ciclo a 95 OC durante 2 minutos, seguido de 15 ciclos de 95 ° C por 15 s, 54 ° C por 40 s, 72 ° C por 1 min. y 20 s; 1 extensión final de 72 ° C durante 5 minutos. Este programa por lo general toma alrededor de 1 hora; el ciclador se puede programar para mantener a 4 O C después de que el ciclismo es completa (si se desea no es necesario). Almacenar las muestras en la nevera (temperatura de la habitación. es ¡muy bien) hasta que esté listo para la segunda ronda de PCR Segunda ronda de PCR: Configurar las reacciones exactamente como el anterior, excepto: 1. Utilice los cebadores internos (F1 y R1 unos a) en el cóctel de mezcla maestra y 2. Uso 2 m l de la primera reacción de PCR como añadió el ADN. 3. Realizar 30 ciclos en lugar de 15. 1) obtener un tubo con una TaqBead. Asegúrese de que el talón está en el fondo del tubo. Si es necesario, presiona el tubo contra una superficie dura para forzar el talón hasta la parte inferior del tubo. Numerar su tubo en la parte superior. Los números en el lado tienden a borrarse en el termociclador. 2) Hacer un cóctel que incluye agua, imprimación. y MgCl2 adicional (pero no el ADN molde). 3) Calcule lo que se necesita añadir al cóctel utilizando la siguiente receta. Digamos que usted tiene 18 muestras (sólo para hacer los cálculos fácil). Usted va a querer lo suficiente cóctel para estas 18 muestras más 1 control negativo. Para asegurarse de que tiene suficiente cóctel, calcular suficiente por un tubo extra: Cada tubo finalmente obtendrá: 0,25 pmol de cebador directo 0,25 pmol de cebador inverso 2 mmol MgCl 2 (0,5 mM añadieron + 1,5 mM ya en grano) de ADN plantilla (10 100 ng / m l) de agua destilada estéril hasta un total de 25 u l Estamos utilizando cebadores que son a una concentración de 0,25 pmol / ul. Utilizaremos 2 ul de ADN molde por reacción. (Para diferentes termocicladores y para diferentes loci y diferentes especies nuevas concentraciones óptimas tienen que ser determinada empíricamente). Estos son los cálculos para el cóctel: Por tubo x 20 (18 muestras, control negativo 1, 1 adicional) 5 Primer (0,25 pmol / ul) 1 ul 20 ul 3 Primer (0,25 pmol / ul) 1 ul 20 ul de MgCl2 (25 mmol) de 0,5 ul 10 ul ddH2O 20,5 ul 410 ul total de cóctel: 460 ul de ADN 2 ul (no en cóctel!) 4) Añadir 23 ul del cóctel a su grano Taq. Para obtener los mejores resultados, deje que el cordón de Taq se disuelva. Puede que golpee suavemente el tubo para acelerar el proceso. 5) Añadir 2 ul de su ADN al tubo. (Si desea utilizar más ADN, de manera que restar la cantidad de agua por tubo de su cóctel). 6) Mezclar el contenido del tubo con la pipeta suavemente dentro y fuera (Si está seguro de que su pipetearon 2 ul de ADN directamente en su mezcla de glóbulos de cóctel / Taq, es necesaria ninguna mezcla). 7) Colocar las muestras en el termociclador e iniciar los ciclos de las instrucciones de su maestro. El termociclador se programó con el siguiente perfil general (el perfil de ciclos óptimo para un termociclador dado variará y debe ser determinada empíricamente): Primera ronda: 1 ciclo a 95 OC durante 2 minutos, seguido de 15 ciclos de 95 ° C por 15 s, 54 ° C por 40 s, 72 ° C por 1 min. y 20 s; 1 extensión final de 72 ° C durante 5 minutos. Este programa por lo general toma alrededor de 1 hora; el ciclador se puede programar para mantener a 4 O C después de que el ciclismo es completa (si se desea no es necesario). Almacenar estas muestras en la nevera o la temperatura ambiente. hasta que esté listo ejecutar la segunda ronda de PCR. Después de segunda ronda de PCR, ejecute 5 ul sobre un gel de agarosa al 1%. El producto de amplificación de gonadotropina debe ser 1.567 pb en tamaño (después de la 2ª ronda). Segunda ronda de PCR: Configurar las reacciones exactamente como el anterior, excepto: 1. Utilice los cebadores internos (F1 y R1 unos a) en el cóctel de mezcla maestra y 2. Uso 2 ul de la primera reacción de PCR como añadió el ADN. 3. Realizar 30 ciclos en lugar de 15. Solución de problemas de la PCR (corto y dulce) Adición de una segunda ronda de PCR como se describe anteriormente debe eliminar muchas de las dificultades en la obtención de producto de PCR. Sin embargo, si usted quiere tratar de optimizar las reacciones utilizando sólo una ronda de PCR, o si usted todavía está teniendo problemas incluso después de hacer dos rondas de PCR, he aquí algunas sugerencias. A veces se encuentra que usted no consigue ninguna amplificación (sin bandas) o la amplificación no específica, lo que significa que tiene varias bandas. Para múltiples bandas, el aumento de temperatura de la etapa de recocido y la disminución de la concentración de magnesio puede ayudar. A veces, la disminución de la cantidad de molde de partida o la reducción de la concentración de los cebadores reducirá amplificación no específica así. Por ejemplo, si uno duplica la concentración de los cebadores utilizados, los productos múltiples se harán evidentes. Cuando su amplificación no funciona, puede asegurarse de que sus reactivos son buenos mediante la ejecución de un control positivo. El kit de cuentas Pharmacia Taq proporciona un control positivo que se puede ejecutar junto con sus muestras. La reducción de la temperatura de hibridación o el aumento de la concentración de magnesio en la reacción reduce la rigurosidad con la que los cebadores de recocido. Por lo tanto, si la no amplificación es el resultado de una falta de especificidad entre los cebadores y la plantilla, estas medidas aumentan su éxito. El aumento de la concentración de la plantilla y la concentración de imprimación también puede ayudar. problemas de contaminación Si una banda (contaminación) aparece en el control negativo, ya sea uno de sus reactivos o su pipeta está contaminada. La contaminación puede ser difícil de descubrir a. Si usted tiene tiempo para averiguar dónde se está produciendo, en primer lugar, limpiar su pipeta y descartar los reactivos más baratos. Intente ejecutar el PCR de nuevo. Si continúa teniendo problemas de contaminación, o si usted no tiene tiempo para jugar al detective, descartar todos los reactivos y volver a empezar. Debido a que la contaminación es potencialmente costosa y requiere mucho tiempo vale la pena alícuota todos los reactivos costosos que utiliza, tales como cebadores y dNTPs. Fotos de producto de PCR de gonadotropina (1% en gel de agarosa) Protocolos: extracción de ADN | Reacción en cadena de la polimerasa